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Western blotting实验完整流程-从蛋白提取到出结果

发布时间:2022-12-05   点击次数:239次

1.提蛋白

(不同细胞类型的蛋白或细胞不同部位的蛋白提取方法或有不同,需要提前查找资料)

我用的是上海白益生物公司的全蛋白提取试剂盒 一般是取100 mg 标本 + 1 ml lysis buffer + 10 ul 磷酸酶抑制剂 + 10ul PMSF + 1 ul 蛋白酶抑制剂 放入研磨器研磨,直至研磨成匀浆(注意冰上操作,有的试剂盒说明在研磨时加液氮),倒入EP管,放入离心机离心,12,000 g / 5 min,取上清。

另一种提蛋白试剂,用RIPA buffer (Gibco) + 1% cOmplete™, EDTA-free Protease Inhibitor (Sigma)

20mg样品(尽量吸尽PBS) + 150 ul RIPA 溶液

冰上放置5~30min(赶时间可短)

蛋白定量-BCA测定方法(酶标板操作)

 

(如果不同样品总蛋白表达量以及蛋白组分差异大,总蛋白调齐之后还需要看内参蛋白的表达是否一致,最后可根据内参蛋白调整上样量)

BSA标准品一般需用PBS稀释液稀释(按照protocol来)。释待测样品至合适浓度,使样品稀释液(稀释后浓度一般不超过测得标准品的最高浓度),总体积为20 μL。据样品数量,按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B ( 50:1 ) 配制适量BCA工作液,充分混匀,每孔加入200 μL BCA工作液。

37℃放置30分钟(可调整时间)后,以标准曲线0号管做参比,在562 nm波长下比色,记录吸光值。以蛋白浓度 ( μg/ul )为横坐标,吸光值为纵坐标,绘出标准曲线。

绘制标准曲线 y = 0.554x+0.0034

据所测样品的吸光值(此处为y值)Average of triplicate, 代入y = 0.554x+0.0034 得到蛋白浓度x值,乘以稀释倍数。根据蛋白上样量确定体积(如上样总体积16ul (加 混匀的4x Laemmli+β-巯基乙醇 煮沸变性),上样量20ug,测得蛋白浓度5ug/ul,则取蛋白提取液体积 volume = 20/5 = 4ul),补PBS 8ul,再加4x Laemmli 4ul, 使上样体积相等。一般99℃水浴变性5min(变性可尝试不同时间,如3min、7min或更长),保存于-80℃。

(4x Laemmli 也可换成 5x loading buffer)加入5x loading buffer (即80ul 样本 加 20ul loading buffer ),摇匀,可用封口膜封口 (防止煮沸时EP管口因压力高而弹开) 煮沸变性(温度时间根据蛋白可做相应调整)。

2. wb

2.1 配胶

蛋白分子量大小不同,所使用的分离胶浓度也不同,常用浓度有6%、8%、10%、12%,分子量越大,所用的胶浓度越低,蛋白电泳速度越快。浓缩胶浓度均为 5%。分离胶的选择:蛋白分子量很小时,推荐使用10-12%,例如蛋白分子量为 21kd 和 34kd ,选取的胶浓度为10%;分子量80kd,选10%;分子量180kd,选6%。

[电泳液也可用BIO-RAD 10x Tris/Glycine/SDS buffer, 直接取100ml buffer + 900ml 纯水稀释即可。配胶可用TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10%或其它浓度]

加样之前先简单介绍一下。一般wb、免疫荧光、免疫组化等组织病理学实验样本要求是每组不低于3个,需要相互比较的组别加样时放于同一块胶上。测目标蛋白之前先跑内参蛋白,检测各样本的蛋白提取量是否相近。内参蛋白量一致,再测目标蛋白。一般我用GAPDH作为内参蛋白(不同组织有区别),分子量~35kd。marker作为指示剂可以显示目标蛋白所处的条带位置及大概分子量,一般加3~5ul。至于目标蛋白,不同蛋白表达量不同,一般10~20ug,可根据第一次的结果进行调整。

2.2 电泳

电泳时长一般1.5h,先用80v 跑~30min,使各样本处于同一水平,待marker开始分离后将电压调至120v 再跑~1h。待loading buffer提示快跑出分离胶时,准备配制转膜液。配方如图。

2.3 转膜(湿跑法)

转膜是整个wb过程中最重要的一步。Glycine14.1 g + Tris 3 g +800 ml 纯水配好后,放入冰袋预冷,之后加甲醇 800ml。PVDF膜一般为2 x 8 cm 大小。PVDF膜和胶要时刻保持湿润,不能干。将PVDF膜放入装有甲醇的培养皿中活化~15秒,再倒入转膜液。转膜时要注意赶走膜与胶之间的气泡。转膜板如下图,在两层滤膜之间依次放入胶和PVDF膜(胶对应转膜板黑色面/仪器黑色面-连接电源负极,PCDF膜对应转膜板透明面/白色面/仪器红色面-连接电源正极)。注意转膜仪器正负极与电源相对应。

转膜时长和蛋白分子量有关,一般100 kb以内的蛋白,转膜时长1kb / 1min,大于100kb,改为1kb / 1.5分钟。一般是恒流 200mA,加冰袋;分子量大时,可用300mA,隔1h 换1次冰袋,因为转膜过程会产生大量热量,避免仪器烧坏。

(半干转膜法)

可用BIO-RAD Trans-Blot Turbo 5x Transfer Buffer (1份 20ml) + ethanol (1份 20ml) + nanopure water (3份 60ml) (需预冷)

2A~2.5A,恒压25V,10min(可根据需要改变条件)BIO-RAD仪器。

2.4 封闭和敷一抗

将PVDF膜放入封闭液(1% milk in 1x TBST + 0.1% Tween 20 )中,室温下封闭~1h,也可根据需要延长至1.5h。封口膜大小一般3.5 x 10.5cm(可用封闭盒,尽量用纯水或TBST清洗)。置于摇床上慢速摇~1h后,置于4℃冰箱过夜。

(验证抗体很重要)

2.5 敷二抗和显影

取出PVDF膜(条带),用TBST洗涤3次,5min /次。若抗体效价不是很好,可适当延长每次的洗涤时间。再用相同的封闭液稀释二抗,置于摇床上摇1h。之后取出条带再用TBST洗涤3次,5min /次。配显影液,我用的是MILLIPORE品牌的,比例1:1,注意避光(可用锡箔纸)。每条带滴约200ml 显影液。

显影成像时因不同曝光时间会影响成像效果,最好取欠曝光,适度曝光以及过度曝光多个曝光时间,取差异最大的图像。

tips: 刚从新鲜组织提前的蛋白记得摇匀分装,应尽量在早期多做点wb条带图,便于后期数据补充分析,提取的蛋白存放时间久以及反复冻融,会导致蛋白降解,影响结果的准确性。

wb房间没有空调,夏天温度太高导致胶很快就凝了,可以将玻璃板放在冰上预冷,冬天用纯水可以压平分离胶,夏天可以用异丙醇压平。

TEMED具有神经毒性和挥发性,应在通风口处使用,避免摇晃,避光低温存储。

因答主测量的蛋白分子量比较靠近,之前一块胶只转了一个蛋白,最近在想直接对整块胶进行转膜,对不同蛋白进行半定量分析,这样既能减少上样误差,还可以直观的看出不同蛋白间的变化趋势。所以试了下对整块胶进行转膜,加入两种抗体,此处一抗种属来源不同,因此二抗也不一样,最后条带结果并不理想。目前还在摸索是否为抗体浓度的因素。

另外,如果是发好的paper,建议将膜保留下来,注意保湿(可保存8~9个月),部分投稿杂志会要求作者提供。

今天面试,教授们提了一个问题,希望与大家共勉。如何确定wb中特异性抗体结合的蛋白就是我们要的目标蛋白,上海白益首先可以根据分子量大小判断,可以做共沉淀把目标蛋白拉下来送去做质谱。可以对膜上的蛋白做色谱和质谱联合分析,另外特异性染色也可以做,抗二抗的抗体可以购买或者自己制作。

通过向同学深入的学习,还可以做阴性对照和阳性对照。阴性对照(确定不表达或极微量表达目标蛋白的样品),比如基因敲除动物,对动物做DNA鉴定,确定没有该蛋白对应的基因序列,再提取蛋白做wb。阳性对照(确定表达目标蛋白的样品),比如某种模型或正常组就是会比该种实验模型的表达高,可以做wb进行比较。

技术是一种手段,但是严谨的科研思维以及善于探索很重要。


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