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胶原蛋白怎样提取与分离?

发布时间:2022-12-07   点击次数:176次
胶原蛋白是生物高分子,动物结缔组织中的主要成分,也是哺乳动物体内含量最多、分布最.广的功能性蛋白,占蛋白质总量的25%~30%,某些生物体甚至高达80%以上。
畜禽源动物组织是人们获取天然胶原蛋白及其胶原肽的主要途径,但由于相关畜类疾病和某些宗教信仰限制了人们对陆生哺乳动物胶原蛋白及其制品的使用,现今正在逐步转向海洋生物中开发。欧洲食品安全局(EFSA)已证实了即使是动物骨骼来源的胶原蛋白也不存在感染疯牛病和其它相关疾病的可能。 
由于氨基酸组成和交联度等方面的差异,使得水产动物尤其是其加工废弃物——皮、骨、鳞中所含有的丰富的胶原蛋白具有很多牲畜胶原蛋白所没有的优点,另外来源于海洋动物的胶原蛋白在一些方面明显优于陆生动物的胶原蛋白,比如具有低抗原性、低过敏性等特性。因此水产胶原蛋白可能逐步替代陆生动物胶原蛋白。 
胶原蛋白种类较多,常见类型为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅺ型。
胶原蛋白因具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性,因此在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛的应用。 

提取与分离

由于胶原是细胞外间质成分,在体内以不溶性大分子结构存在,并与蛋白多糖、糖蛋白等结合在一起,因此胶原的制备包括材料的选择、预处理、酸碱酶盐水法提取、不同类型胶原的分离和纯化。 

预处理
除胶原蛋白外,动物骨中还含有油脂、多种矿物质和其他杂质,因此在被用于提取胶原蛋白之前必须进行预处理。先剔除动物骨上残留的肉质和肌腱等杂物,粉碎后用正丁醇或正己烷萃取出骨油。最后除去骨中无机物以提高胶原蛋白的得率。除去骨中的矿物质可用稀酸或EDTA溶液。有人用原料用5倍质量的1.0moL/LHCL脱钙处理2d,用正乙烷脱脂后再用胃蛋白酶酶解,在加酶量150U/g,pH值1.7,37℃条件下处理120min,然后在固液比1∶6的情况下抽提5h,在此条件下,提取率可达18%;还有人用EDTA溶液(pH7.4)浸泡骨料5d,可有效脱去骨料中的羟基磷灰石。 
胶原蛋白的提取一般有三种方法:一是高压辅助的物理方法;二是用溶剂预处理结合低温或热水抽提的化学方法,根据溶剂的不同,可分为热水浸提法、酸法、碱法、盐法;三是用酶的生物化学法。一般来说,高压辅助和热水抽提针对明胶的提取,而低温抽提和酶法针对胶原的提取,但其基本原理都是根据胶原蛋白的特性改变蛋白质所在的外界环境,把胶原蛋白从其他蛋白质中分离出来。 
在实际提取过程中,不同提取方法之间往往相互结合,可以得到较好的提取效果。采用超高压处理系统对原料给予高压处理一段时间,使其组织结构和胶原蛋白的三股螺旋结构发生松弛、变性,便于分离提取。 

热水提取法是将原料经过除杂蛋白等前处理之后,在一定条件下直接用热水浸提已经变性了的胶原蛋白或胶原蛋白水解物,使用的温度有100℃沸水浴、60-70℃、40-45℃。

酸法

酸法提取是利用一定浓度的酸溶液在一定的条件下提取胶原蛋白,主要采用低离子浓度酸性条件破坏分子间盐键和希夫碱,而引起纤维膨胀、溶解,采用酸法提取的胶原蛋白通常成为酸溶性胶原蛋白。酸溶解法可将没有交联的胶原分子溶解出来,也可溶解含有醛胺类交联键的胶原纤维,然后释放到溶剂中。酸法是提取胶原蛋白比较常用和有效的方法,用低温酸法提取的胶原最大.程度的保持了其三螺旋结构,适用于医用生物材料及原料的制备。通常的做法是将适当浓度的酸液按一定料液比加入到经过预处理的骨粉中,于0~25℃搅拌提取一定时间。在采用酸法进行胶原蛋白的提取时,注意提取温度不宜过高,以免胶原蛋白的生物活性发生破坏。取样经前处理后,匀浆在低温下用酸浸提,离心即可得酸溶性胶原蛋白(acid-soluble collagen,ASC)。作为溶剂使用的酸,主要有盐酸、磷酸、甲酸、乙酸、苹果酸、柠檬酸等,但大多数研究集中于乙酸抽提,像Maria Sadowska等用0.5mol/L柠檬酸在室温下提取骨胶原蛋白,其提取率略低于乙酸提取。柠檬酸因不产生颜色和异味得以广泛使用于食品工业的胶原蛋白的提取

酸法处理时,反应强烈,水解*,多生成氨基酸混合物,而且使用酸提取时,根据酸浓度、水解温度、水解时间等条件的不同,可以得到分子量不均的胶原水解物。但是在即使中等浓度酸*水解过程中色氨酸也会全部被破坏,丝氨酸和酪氨酸也会部分被破坏,且设备腐蚀严重。因此,酸法溶出生物医用胶原要准确控制酸度、温度、时间等影响因素。由于各种不足,酸法很少单独使用,一般和酶法配合。比如以猪皮为原料,在柠檬酸(pH8.6)和胃蛋白酶协同下提取胶原蛋白。在处理后的猪皮中加0.05moL/L含有胃蛋白酶的柠檬酸溶液(pH2.5-3)处理一段时间,然后再用NaCL盐析,最后提取率为12.35%,提取物保持了完整三股螺旋结构的I型胶原蛋白。还有人以雏鸡胸软骨为原材料,在0.5moL/L醋酸条件下经胃蛋白酶多次消化,在4℃,20000r条件下离心20min,最后应用DEAE-Sephadex A-50进行离子交换层析,之后透析,再用NaCL盐析,最后得到纯化的胶原蛋白Ⅱ型。

碱法

碱法提取即利用一定浓度的碱在一定的外界条件下提取胶原蛋白,碱处理法中常用的处理剂为石灰、氢氧化钠、碳酸钠等,用氢氧化钠浸提时效果较好。一般的是把样品匀浆后,用碱溶液多次溶胀后,再离心提取。但由于易引起蛋白质变性,如胶原肽键水解,含羟基、疏基的氨基酸全部被破坏;所得产物等电点pH值较低,天冬酞胺和谷氨酞胺分别转变为天冬氨酸和谷氨酸,得到的水解产物分子量较在酸性溶液中比低等问题,若比较严重的话,还会产生D、L-型氨基酸消旋混合物,若D型氨基酸含量高过L 型氨基酸,则会抑制L-型氨基酸的吸收,有些D型氨基酸有毒,甚至有致癌、致畸和致突变的作用。而且碱法提取的含量较低,用氢氧化钠从鱿鱼皮中提取碱溶性胶原蛋白,其得率只有3%(以湿

基计)。所以,若想提取结构完整、使用安全的胶原蛋白,很少采用此方法。有关单独采用碱法提取胶原蛋白的报道不多,一般是碱法提取和酸法提法结合使用。比如在4℃条件下,鱼骨用0.1moL/L的NaOH浸泡6h,再用2.5%NaCl浸泡6h去除杂蛋白,用10%的异丙醇溶液去除脂肪,0.1moL/L的柠檬酸浸泡3d,最后得到无色无味的胶原蛋白,提取率为11.87%。 
注意,无论酸法或碱法,均可有效地提取胶原蛋白,有人分别采用醋酸- 盐酸的混合酸液(pH3.0)和NaOH溶液(pH12.0)提取骨胶原蛋白,提取率基本相当。但是,这两种方法提取胶原蛋白不仅容易影响胶原蛋白的生物活性,而且提取后产生的酸性或碱性废液必须进行适当处理,以避免对环境造成污染。 

盐法

盐法提取是利用各种不同的盐在不同的浓度条件下提取盐溶性胶原蛋白的方法。常用来提取胶原的盐有盐酸-三羟甲基胺基甲烷(Tris-HCl)、氯化钠、柠檬酸盐等。在中性条件下,当盐的浓度达到一定量时,胶原就会溶解在其中,但是胶原的溶解和分级受中性盐效应影响,有的盐可提高胶原的稳定性,而有的则可降低其构象稳定性,从而对提取天然胶原蛋白很不利。此外,可采用不同浓度的氯化钠对提取的胶原蛋白进行盐析处理,可以沉淀出不同类型的胶原蛋白。

酶法

酶法提取是指可溶性胶原和酸溶性胶原被提取后,需用一些蛋白酶,如胶原酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等水解,得到不同的酶促溶性胶原蛋白。所使用的蛋白酶主要分3种:动物蛋白酶(如胰蛋白酶,胃蛋白酶),植物蛋白酶(如木瓜蛋白酶,菠萝蛋白酶),微生物蛋白酶(如碱性蛋白酶,中性蛋白酶)。在对酶法水解胶原蛋白的研究中,以碱性蛋白酶应用最多。 

将胶原进行限制性降解,即将末端肽切割下来,由于胶原肽链间的共价键都是通过分子末端肽里的赖氨酸或羟赖氨酸的相互作用形成的,末端肽被切下后,含三螺旋结构的主体部分可溶于稀有机酸而被提取出来。用酶处理,可以水解掉胶原纤维蛋白的末端肽,提高胶原蛋白的产率;而且还不会破坏胶原蛋白的三股螺旋结构,保持其特性。影响酶提取的因素有很多,如酶浓度、酶与底物的比例、酶解时间、酶解温度、pH值以及料液比等。在实际操作中,大多数采用酶复合法提取胶原蛋白,较多的是使用胃蛋白酶提取,有机酸多为乙酸。
酶解胶原蛋白的工艺主要分为单酶水解法和多酶水解法。多酶水解法又分为混合酶水解法(比如牛胰蛋白酶,链霉菌蛋白酶,芽孢杆菌蛋白酶混合)和分步酶水解法,酶法提取皮胶原具体实验工艺及条件的选取通常应考虑要开发的产品对分子量的要求,要得到分子量较小的胶原多肽一般采用多酶水解法。影响酶解效果的因素主要有:酶的种类、加酶量、酶解温度、酶解时间、pH值及料水比。采用酶法提取骨料中的胶原蛋白,既能有效缩短提取时间,又能获得具有良好生物活性的胶原蛋白,而且对环境的污染也较小。胶原蛋白不易被普通蛋白酶水解,但能被动物胶原酶断裂,断裂的碎片自动变性后可被普通蛋白酶水解。胃蛋白酶水解胶原蛋白的适宜条件为pH 1.65~1.70、温度37℃。 
有人以猪骨为原料,用蛋白酶的酶解反应代替传统制胶工艺,对骨胶原的酶解反应与酶法制胶工艺进行了试验研究。结果表明:以胃蛋白酶对骨胶原的提取率最高(46.14%),其次是胰蛋白酶(43.42%),接下来是中性蛋白酶(30.14%),最后是碱性蛋白酶(21.15%)。并且通过单因素和正交试验对胃蛋白酶酶解反应中各主要影响因素进行了优化。试验结果表明,胃蛋白酶提取的最.优条件是,胃蛋白酶的浓度是1%,在pH2.0的条件下酶解48h,然后在浓度为10%(w/v)的NaCL溶液中盐析24h,最后骨胶原的回收率为64.77%,骨胶原的提取率为49.75%。还有人用胃蛋白酶提取猪皮胶原蛋白,分别在水解0、2、6、10、14、18、22、26h时对四种不同胃蛋白酶用量(分别为1%、2%、2.5%、3%)的试样取样检测,采用一阶HILL方程模拟胃蛋白酶提取猪皮胶原蛋白的进程以及胃蛋白酶水解速率的衰减过程,最后得出2%的胃蛋白酶用量和6-7h的水解时间提取率最大。还有人用以新鲜猪皮为原料,在50-52℃的条件下用胰酶进行水解,在酶用量为 5000:1~10000:1,pH值为9,反应2-3h,原料:水为1:2的条件下酶解。结果表明:总蛋白质的提取率≥80%。 
  采用酶法提取胶原蛋白时,必须严格控制提取条件:
首先,酶作用时间必须适当。如果时间过短,胶原蛋白就不能充分释放到提取液中,影响提取率;如果酶作用时间过长,胶原蛋白会水解过度,产生过多的苦味小分子低聚肽,不仅会增加分离纯化的难度,也会影响胶原蛋白的功能特性和生物活性。
其次,酶解温度要适宜。温度过低,酶的作用效果不明显;温度过高会引起酶的失活和胶原蛋白的变性。据报道,当介质pH略低于中性时,胶原蛋白的变性温度为40~41℃,当介质pH为酸性时,胶原蛋白的变性温度为38~39℃,而且鱼皮胶原蛋白的变性温度要比猪皮胶原蛋白的变性温度低7~12℃。所以,如果要使提取的胶原蛋白具有良好的生物活性,在提取过程中应使提取温度低于变性温度。
第三,需选用适当的酶。一般从陆生哺乳动物组织中提取胶原蛋白时,采用胃蛋白酶在其最适作用温度下进行提取是合理的,但对于鱼类等水生动物,由于其胶原蛋白的变性温度比陆生哺乳动物低,因此许多蛋白酶便不适用,如果在这些酶的最适作用温度下提取可能会破坏胶原蛋白的某些功能特性和生物活性。采用酶法提取胶原蛋白及其多肽的研究主要是从动物皮及其加工副产物中,应用酶法从动物骨中提取胶原蛋白及其多肽报道较少。

纯化

可用于胶原蛋白的纯化方法包括盐析法、透析法、离心法、电泳法和色谱法,其中盐析法、离心法和电泳法最为常用。由于单一方法难以*分离纯化胶原蛋白,实际操作都是通过复合法来达到分离纯化胶原蛋白的目的。盐析法一般采用高浓度NaCl;离心法常选用制备型低温超速离心机;电泳法多采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE),该法既可用于胶原蛋白的分离纯化,还可用来测定胶原蛋白分子的相对分子质量。像有人用破碎、酶解、盐析三步法提纯苏尼特羊骨骼I型胶原蛋白。先去除骨头里的非胶原物质,然后往沉淀中10%的胃蛋白酶,在4℃的条件下消化24h,以14000r/min离心40min。弃沉淀往上清液中加NaCL,使它终浓度达到0.9moL/L,静置过夜,再离心,最后的沉淀就是I型胶原蛋白。


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